多发性骨髓瘤（multiplemyeloma）是血液系统第二常见的恶性肿瘤，目前尚无标准的治疗方法。但是现在包含多种新药的4药联合方案的总有效率接近%，因此，下阶段主要工作集中在深度反应的检测，即测量微小残留病灶的评估。MRD状态不仅与PFS和OS相关，而且可能作为加速药物批准的可靠的替代标志物。在这里，我们将讨论目前使用的MRD检测方法，跨实验室和临床试验验证的挑战，正在尝试中的检测技术，以及MRD在多发性骨髓瘤中临床应用的未来方向。
下图显示了新诊断骨髓瘤不同诱导方案的缓解率。
诱导治疗后的MRD状态对预后有很强的影响。目前用于MRD评估的工具包括流式细胞术、基于NGS的测试和基于PET的成像等技术的方法。其他方法正在尝试中，包括基于外周血的检测，如质谱和成像技术，包括利用89ZrDaratumumab等化合物的新型免疫PET研究。至关重要的是，肿瘤学家必须熟悉这些技术，因为临床试验中使用的检测技术存在巨大的异质性，使得结果的比较变得困难。这种异质性，以及在临床决策中缺乏标准化和不清晰的使用结果是真正的个体化治疗和长期疾病控制的障碍。
基于骨髓的检测
基于骨髓的检测是目前评估MM患者MRD的金标准。该方法的缺点在于：对于骨髓中的疾病，如果是低水平的，可以是片状的，这样盲目的活组织检查可能会错过活动性疾病的部位。同样，也无法检测髓外部位的疾病。骨髓MRD阴性结果需要高度怀疑混杂因素，血液稀释、操作人员间的技术差异以及样本中的细胞数量和质量也会影响结果。最后，操作是侵入性的，可能给患者带来不舒服和不方便。
多参数流式细胞术（MFC）：
仍然是评估多发性骨髓瘤MRD的标准检测方法。第一个通过MFC测量MRD来评估预后的前瞻性研究能够将CR患者分为两个不同的预后组。通过常规评估被认为是CR的患者中有36%被MFC（10-4）发现有MRD，并且PFS和OS比MRD阴性的患者短。从这个发现后，在检测少量疾病和尝试标准化方面有了进一步的改进。
最敏感的流式细胞术技术包括优化的EuroFlow的8色2管面板，建议对0万个细胞进行分析，报告的灵敏度为0000（10?6）个细胞中的2个肿瘤细胞，也称为“下一代流式细胞术”；还有一个是美国版本，由纽约纪念斯隆凯特林癌症中心开发，基于10色单管面板，灵敏度为0000个肿瘤细胞中的6个，但是可以检测万个细胞。与EuroFlow方法相比，单管方法的优势包括成本和工作量方面的资源强度降低50%。两个试管共有的四个主干标记应该是CD38、CD、CD45和CD19。
在反应深度方面，Martinez-Flores等人研究了MFC评估的MRD的预后差异，MFC以10-5为分界点进行分层。主要是一项基于各种敏感性临界值的生存差异研究，通过MFC技术发现MRD阴性且敏感度小于10?5的患者的中位总生存期未达到，而MRD阴性但敏感度大于10?5的患者中位OS为个月。当仅限于CR患者时，两组患者均未达到总生存率。同样，Paiva等人通过流式细胞术检测了PETHEMA/GEMMENOS65试验的结果。在MRD患者中，根据MRD阳性水平≥2×10?6至10?5、≥10?5至10?4和≥10?4的对数范围，PFS没有显著差异，这表明即使在极低水平下，MRD阳性也预示着在宏观水平上的不良预后。另外，本研究还表明，实现MRD阴性克服了不良的危险因素，因为在所有R-ISS阶段的疾病中，36个月的PFS发生率没有显著差异。
流式细胞仪的实用性要求快速样品处理，以保持细胞组成和活力。有人建议，样本中的细胞存活率应大于85%，并且抽吸物可以反应骨髓环境中预期的不同细胞群。这一要求对在多国试验中使用单一参考实验室提出了挑战，故提出在本地进行检测。这反过来又需要高度的标准化。尽管按照FDA、EuroFlowConsortium和IMWG的建议在标准化方面做出了努力，但即使在大型的、改变实践的试验，包括MFCMRD评估，敏感性阈值都低于建议的统一值和/或次优抗体组合。因为获得的细胞数量、抗体组合和分析策略缺乏标准化，导致阈值在10?4到10?5范围内，而不是目前最佳的2–3*10?6。
下表显示了不同的参数，包括评估的细胞数，对灵敏度阈值的影响。
2.2.NGS
第一个分子MRD评估是等位基因特异性寡核苷酸聚合酶链反应（ASO-PCR），使用针对患者基线肿瘤样本中IGH基因CDR3区域的特异性分析。由于适用性、资源强度和成本问题，该技术已被更现代的肿瘤特异性V（D）J序列评估和流式细胞术所取代。
分子MRD检测已经发展到使用高灵敏度的下一代测序（NGS）来识别和追踪肿瘤特异性免疫球蛋白V（D）J重排。免疫球蛋白重链（IGH）可变区V（D）J重排是B细胞发育过程中免疫球蛋白基因成熟的早期形成步骤，随后抗原依赖性体细胞超突变和类开关重组，形成具有成熟免疫球蛋白基因序列的浆细胞。许多研究已经证明，任何一个序列在一个以上的B细胞克隆中独立出现的概率极低。当B细胞克隆转化为浆细胞肿瘤时，V（D）J序列将被所有肿瘤细胞共享，而在正常细胞中缺失。作为一种在疾病过程中没有明显持久驱动作用的早期基因组事件，序列（尤其是CDR3区域）随着时间的推移通常保持稳定[42]。这些特征非常适合通过测序确定MRD。克隆性免疫球蛋白kappa（IGK）和lambda（IGL）轻链CDR3序列也可用于追踪，但由于它们缺乏D段，因此不如IGH具有肿瘤特异性，导致多样性降低，并增加了正常B细胞偶然拥有相同序列的可能性。
在撰写本报告时，FDA唯一批准的NGS分析是AdaptiveBiotechnologies的ClonoSeq分析（LymphoSIGHT平台），它可以在单个试管中识别和跟踪所有免疫球蛋白基因（即IGH、IGK和IGL）的潜在肿瘤特异性序列。
在比较NGS和MFC的第一项研究中，对GEM和GEM05MENOS65患者的样本进行了克隆测定（敏感性=10?6）。MFC采用4色技术（灵敏度10?4至10?5）。9%的研究人群没有适合于通过该分析追踪的V（D）J重排，也无法测序。作者发现，在敏感性小于10-5中，测序和MFC评估MRD均阴性的患者的预后优于测序阳性但MFC阴性的患者。鉴于两种模式的灵敏度阈值不同，尚不能被视为两种模式之间的任何比较。
NGS的局限性与流式细胞术的局限性有一些相似之处，即需要有创性的样本采集和足够数量的细胞进行评估。然而，一个明显的优点是不需要活细胞，可以从储存的样本中进行测序。此外，流式细胞术的检测需要高达0万个细胞（考虑到制备过程中的损失或事件数量较少），但据报道，低至万个细胞的DNA可以实现充分的NGS检测。但这必须与提取基线样本的要求相平衡——这是建立肿瘤特异性V（D）J序列以随时间追踪的要求。这可能是在基线样本无法用于测序的情况下，也是尝试使用这些测试作为治疗决定的主要限制。此外，并不是每个病人的疾病都适合捕捉。血液稀释可以人为地降低克隆负担，并通过NGS（以及流式细胞术）掩盖检测。在早期评估NGS方法的研究中，估计有10-20%的患者的MRD被检测漏掉，可能是由于方法的不完善。在最近的文献中，淋巴追踪和克隆分析的克隆性检测率都上升到了95%。
在最近的另一项研究中，发现用于追踪的克隆CDR3序列也可以从大量RNA测序中识别出来。从实用的角度来看，这是重要的进展，因为它们显示了检测肿瘤特异性CDR3序列用于MRD追踪的可行性，而无需在基线时进行专门的免疫球蛋白基因测序分析。相反，肿瘤的克隆性可以通过包括免疫球蛋白基因座和其他感兴趣区域的通用测序分析来评估，无论是通过基于DNA或RNA的测序。在基线检查时确定的肿瘤特异性CDR3序列可用于指导后续使用基于NGS的MRD分析，这些分析对于低疾病负担下的克隆追踪仍然是最佳的。
外周血检测
多种研究显示发现循环骨髓瘤细胞与相对较差的预后相关。在一项旨在评估先前讨论的LymphoSIGHTNGSplatform在外周血中的效用的研究中，观察到外周血骨髓瘤克隆水平比配对骨髓水平低约倍。足够的敏感性水平通常取决于较高的骨髓疾病负担，这是从外周血室评估MRD的一个主要限制，与其他一些血液系统恶性肿瘤（即急性淋巴细胞白血病）相比，骨髓瘤具有更少的循环细胞。
由于更高的敏感性水平（2*10?6）最近的流式细胞术技术也同样应用于外周血，在大多数治疗初期患者中，更高水平的循环骨髓瘤细胞与更差的预后相关。为了将外周血流式细胞术应用于治疗后，71名完全缓解的患者观察到应用骨髓流式细胞术鉴定出35例（49%）患者的MRD，而外周血流式细胞术仅鉴定出12例骨髓患者MRD。目前对于否可以通过外周血替代骨髓样本评估MRD值得怀疑，但对于可能假阴性的骨髓分析（即斑片状或髓外疾病）是有价值的。在循环中检测到的MRD在复发或进展方面也可能存在不同的预后因素，但这仍有待明确证实。
另一种在这一领域受到
