年4月，《NatureMedicine》杂志在线发表文章，医院中国科学家卢铀教授团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在体外T细胞中编辑PD-1基因，经体外T细胞培养扩增，再输回非小细胞肺癌（NSCLC）受试者，首次证明了该疗法在NSCLC中的安全性和可行性。年6月，美国IntelliaTherapeutics公司（NTLA）和再生元公司的科学家在最新一期《新英格兰医学杂志》上撰文称，治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性多发性神经病（ATTR）的CRISPR基因编辑疗法NTLA-在Ⅰ期临床试验中取得积极结果。
研发新的癌症治疗方法、攻克遗传性疾病，
CRISPR技术已成为基因治疗方法中
又一种争相研究和应用的方向。
那什么是CRISPR技术呢？
PARTONE
CRISPR技术背景
CRISPR/Cas系统是在大多数细菌（40%）和古细菌（90%）中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗入侵的病*及外源DNA。当噬菌体感染细菌后，病*DNA进入细菌细胞，细菌细胞表达Cas复合体对噬菌体DNA进行切割得到间隔序列，间隔序列在cas1和cas2作用下插入到CRISPR最前端形成免疫。CRISPR是一段规律间隔成簇短回文重复序列，由众多短而保守的重复序列区和间隔区组成，重复序列用于稳定RNA的整体二级结构，间隔区是被细菌俘获的外源DNA序列，前导区被认为是CRISPR序列的启动子，多个CRISPR相关基因被命名为Cas家族，与CRISPR序列区域共同发生作用，形成高度保守的CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统在基因敲除、基因沉默、基因敲入、基因激活及表观遗传修饰等方面应用广泛。
CRISPR/CAS系统
PARTTWO
CRISPR/Cas系统分类
基于不同的效应蛋白，CRISPR-Cas系统被分为两类。第一类切割外源核酸效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，分Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型；第二类的作用因子为单一的Cas蛋白，分Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型，其中应用最广泛是Ⅱ型的Cas9蛋白，CRISPR/Cas9基因编辑系统荣获年诺贝尔化学奖。
CRISPR/CAS系统分类1
PARTTHREE
CRISPR/Cas9作用机理
CRISPR/Cas9基因编辑系统作用机理分三阶段：
1
外源DNA俘获
即获得新间隔区序列，通过Cas1/2蛋白复合物识别入侵DNA的PAM区域，将临近PAM的DNA序列作为原型间隔序列并剪切下来，在其他酶协助下插入临近CRISPR序列的前导区下游，DNA修复被打开的双链缺口。
2
成熟CRISPRRNA（crRNA）的合成
CRISPR在前导区调控下转录产生crRNA前体（pre-crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）。pre-crRNA、tracrRNA与Cas9蛋白组成复合体，在核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）协助下进行剪切，最终形成一段短小的crRNA。
3
靶向干扰
若相同病*DNA入侵，复合物识别与crRNA互补的间隔序列，Cas9蛋白在向导RNA（sgRNA）引导下结合靶标DNA并进行切割。
作用机理2
PARTFOUR
CRISPR技术在基因治疗领域的应用
目前CRISPR用于人体治疗主要有两种方式。一种是体外基因编辑，类似于CAR-T，先将细胞从人体取出，在体外进行基因编辑后，重新输回患者体内。年4月，Dana-Farber/Boston儿童癌症和血液疾病中心以及麻省大学医学院的研究人员在《NatureMedicine》发文，将CRISPR-Cas9基因编辑应用于镰状细胞（贫血）病和β-地中海贫血患者自身的血液干细胞，可更高效地对血液干细胞进行编辑。基因编辑公司CRISPRTherapeutics也于年12月6日公司发布了针对患有输血依赖性β-地中海贫血的临床试验结果，入组患者治疗效果良好且持久。另外，年11月宾夕法尼亚大学医学院的医生也首次尝试使用基因编辑工具—CRISPR来治疗癌症患者，从两位多发性骨髓瘤和一名肉瘤患者中提取T细胞，对其进行基因改造后重新输注回患者体内，以帮助患者识别和抗击癌症。
另一种为体内基因编辑，利用载体将CRISPR/Cas直接递送至病变部位或需要靶向的器官，在人体内直接改造病变基因。Intellia公布的NTLA-试验，应用的便是体内编辑技术，通过静脉给药，将基因组编辑系统传递到肝脏后，改造人体内的病变基因。
对于体外基因编辑，研发人员可以通过特定的技术，识别脱靶细胞与正常细胞，所以目前体外基因编辑的临床试验进展较快，但是体内基因编辑可以直接靶向组织和器官，针对的应用疾病比较广泛。
总体说来，以CRISPR基因编辑技术作为基因治疗方式的产品研发管线众多，涵盖了血液疾病、实体肿瘤、罕见病和再生医学等领域。在我国，年1月，博雅辑因针对输血依赖型β地中海贫血的基因编辑疗法产品ET-01的临床试验也申请(IND)获国家药监局批准。
PARTFIVE
CRISPR技术的挑战
1
技术的完善
在非目标靶点位置产生非特异性的切割，一般被称为脱靶效应，脱靶效应是制约CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于医疗领域的关键原因之一。
2
HDR效率问题
细胞核内同时存在非同源性末端连接（NHEJ）和同源介导修复（HDR）这两种双链DNA修复机制。通常认为，HDR的发生几率低于NHEJ，且HDR的发生依赖于在双链DNA断裂的同时在细胞核内存在与断裂位点周边序列具有同源性的外源修复模板（donortemplate）。
3
免疫排斥
外源性蛋白及病*载体进入体内，使机体产生免疫排斥，涉及安全性问题。
丹纳赫生命科学旗下IDT公司Alt-R?CRISPR基因编辑系统，在降低整体脱靶率的同时实现高效切割，并能通过优化HDR实现高效率的基因插入。
主要采取转染核糖蛋白复合物（RNP），即Cas9蛋白和gRNA结合的复合物，此系统分别对crRNA、tracrRNA、sgRNA序列进行优化缩短、化学修饰，再通过电穿孔转染RNP进行精准基因编辑。
References
[1]EugeneV.KooninandKiraS.Makarova.OriginsandevolutionofCRISPR-CasSystems.Phil.Trans.R.Soc.B
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[2]HelerR,SamaiP,ModellJW,WeinerC,GoldbergGW,BikardD,MarraffiniLA.Cas9specifiesfunctionalviraltargetsduringCRISPR-Casadaptation.Nature.Mar12;():-.
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